通用名稱(chēng)
非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒(熒光探針?lè )?,免提?。?/p>
主要成分
作用與用途
本試劑盒用于定性檢測非洲豬瘟病毒(Africanswine fever virus,ASFV)特異性核酸片段,為臨床監測和診斷非洲豬瘟病毒感染豬提供檢測數據。非洲豬瘟確診應根據臨床癥狀,流行病學(xué)及實(shí)驗室檢測結果進(jìn)行綜合判定。
檢測原理
本試劑盒以PCR方法結合熒光探針,核酸提取與純化同步操作,直接通過(guò)實(shí)時(shí)監測PCR擴增產(chǎn)物的累積過(guò)程中熒光信號的變化對非洲豬瘟病毒(African swinefevervirus,ASFV)的特異性核酸片段進(jìn)行檢測。
用法
1. 適用樣本類(lèi)型本試劑盒適用于豬口鼻眼拭子、組織和血液或血清等樣本中非洲豬瘟病毒的核酸檢測。
2. 樣本采集
2.1 口鼻眼拭子樣本的采集:采集患病豬口鼻眼拭子樣本,用專(zhuān)用采樣棉簽,適度拭抹口腔分泌物和鼻腔分泌物,眼分泌物要用拭子在眼瞼下充分擦拭,迅速將棉簽放入裝有400μL樣本稀釋液的采樣管中,在靠近頂端處折斷棉簽桿,旋緊管蓋并密封,以防干燥。拭子采樣以溶解到樣本稀釋液中可以看到組織懸浮物為最佳。
2.2 組織樣本的采集:無(wú)菌采集病豬組織樣本約0.1g,置于1.5mL無(wú)菌離心管中。
2.3 全血樣本的采集:抽取豬靜脈血1mL,置于含有適量抗凝劑的采血管中(抗凝劑建議采用EDTA或檸檬酸三鈉,不應采用肝素);
2.4 血清樣本的采集:抽取豬靜脈血1mL,注入無(wú)菌收集管中,室溫不超過(guò)4小時(shí)(約30-60分鐘),待樣本自行析出血清,或直接1600rpm離心5分鐘分離出血清,轉移至新的滅菌離心管中備用。
3. 保存
采集的待測樣本可立即用于檢測,待測樣本在2~8℃保存不應超過(guò)三天;-20±5℃保存不超過(guò)一個(gè)月;-70℃以下可以長(cháng)期保存。應避免反復凍融。
操作程序
1. 擴增試劑準備
從試劑盒中取出ASFV-PCR反應液、ASFV-陰性對照品和ASFV-陽(yáng)性對照品,待所有組分完全溶解后,振蕩混勻5秒,瞬時(shí)離心5秒。
2. 樣本處理
2.1 口鼻眼拭子樣本處理:無(wú)需樣本處理,即可直接上樣。
2.2 組織樣本處理:取約黃豆粒大小組織樣本(約0.1g)置于無(wú)菌1.5mL離心管中,加入200μL樣本稀釋液,使用手持式組織研磨儀充分研磨至勻漿。另取出一個(gè)新的無(wú)菌1.5mL離心管,加入30μL組織樣本裂解液,再加入30μL組織勻漿液,渦旋混勻,置于95℃加熱5min后,12000rpm離心2min,吸取上清液5μL上樣。
2.3 血液樣本處理:
全血樣本處理:經(jīng)樣本稀釋液稀釋10倍后,即可直接上樣;
血清樣本處理:經(jīng)樣本稀釋液稀釋5倍后,即可直接上樣。
3. 加樣
按下表體系,在0.2mLPCR管中配制反應液。試劑用畢后將剩余試劑立即放入-20±5℃保存。
3.1 在一個(gè)分裝有反應液的PCR反應管中加入5μL的ASFV-陰性對照品;
3.2 將步驟2.樣本處理中取得的待檢樣本充分震蕩混勻,然后按照5μL/樣本分別加入分裝有反應液的PCR反應管中;
3.3 在最后一個(gè)分裝有反應液的PCR反應管中加入5μL的ASFV-陽(yáng)性對照品;
以上操作建議在冰浴條件下進(jìn)行,操作完畢壓緊管蓋,瞬時(shí)離心。
注:使用卡尤迪生物科技Mini8全系列熒光定量PCR儀時(shí),建議使用無(wú)色透明的0.2mLPCR管,切勿使用有顏色,磨砂的PCR管,因為該儀器熒光讀取方式為側面激發(fā)和收集熒光信號。
4. PCR擴增
將反應管放置到PCR檢測儀內,記錄加樣順序。
4.1 按下表設置反應條件
4.2 熒光通道的選擇
請選擇FAM通道檢測ASFV的核酸。
判定
1. 試驗成立條件:
1.1 陰性對照品FAM檢測通道無(wú)S型擴增曲線(xiàn);
1.2 陽(yáng)性對照品FAM檢測通道有典型S型擴增曲線(xiàn)且Ct值≤23;
1.3 陰、陽(yáng)性對照品檢測符合上述結果,則實(shí)驗有效。
2. 結果判定
2.1 如果樣本在FAM 通道有典型S型擴增曲線(xiàn)且Ct值≤23,則判定為非洲豬瘟病毒核酸檢測陽(yáng)性;
2.2 如果FAM通道有典型S型擴增曲線(xiàn)且 Ct值在23-30之間,則需要復檢。復檢結果如果樣本FAM 通道仍有典型S型擴增曲線(xiàn)且Ct值≤30,則判定為非洲豬瘟病毒核酸檢測陽(yáng)性,否則為陰性。
注意事項
1. 開(kāi)始檢測前請仔細閱讀本說(shuō)明書(shū),按要求操作。
2. 各區物品均為專(zhuān)用,不得交叉使用,避免污染;實(shí)驗后立即清潔工作臺。
3. 擴增產(chǎn)物的污染,很容易出現假陽(yáng)性結果。因此,臨床實(shí)驗室應嚴格按照《臨床基因擴增實(shí)驗室工作規范》配備設備及操作人員。
4. 本試劑盒檢測結果僅供科研使用,對病豬的臨床診治應結合其癥狀/體征,病史,其他實(shí)驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。
5. 檢測為陰性,并不代表為非感染狀態(tài),具體診斷結果須結合其他臨床診斷結果判斷。造成檢測為陰性的可能是:①不合理樣本采集、轉運及處理、樣本中病毒濃度過(guò)低,②未經(jīng)驗證的其他干擾因素如:服用抗病毒藥物等。
6. 樣本中DNA濃度低于本產(chǎn)品的最低檢出限時(shí)可能出現假陰性。
7. 核酸反應液分裝時(shí)應盡量避免產(chǎn)生氣泡,上機前注意檢查各熒光定量PCR反應管是否蓋緊,以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器。
儲存與有效期
本試劑盒中樣本裂解液和樣本稀釋液應儲存于 2~8℃;其余組份應儲存于-20±5℃的避光條件,有效期為12個(gè)月,盡量避免反復凍融。
批準文號
獸藥生字031418939